1.本发明涉及用于预防或辅助治疗神经炎症及睡眠问题的酪蛋乳制品及食源性活性肽药物开发技术领域，具体涉及酪蛋白抗炎小分子肽及其制备方法和在改善睡眠中的白抗应用。
背景技术：
2.酪蛋白是炎小用流牛奶中含量最多的一种蛋白，高达80％，分肽方法其资源丰富、制备来源广泛、和改营养价值高，善睡对产品开发极具优势。眠中酪蛋白氨基酸组成特殊，酪蛋其中含有较多的白抗脯氨酸，因其良好的炎小用流生物特性，已开发多种生物活性肽，分肽方法如降血压、制备抗氧化肽以及降血糖活性肽等。和改炎症是善睡机体对外界刺激的一种防御反应，但过度的炎症反应会导致一些与细胞因子大量产生及组织破坏等相关的免疫系统疾病。并且，神经炎症可引发多种神经退行性疾病，包括阿尔茨海默症(ad)，帕金森病(pd)和多发性硬化症等。已有研究表明慢性压力应激会导致小鼠中神经炎症因子显著上调，包括一氧化氮(no)和促炎细胞因子，例如白介素-1β(il-1β)，白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)以及其他一些具有潜在神经毒性的化合物。这些因子在中枢神经系统中的过度产生会触发炎症反应，并最终导致神经变性。重要的是，持续进行性压力带来的神经炎症会加速脑组织损伤和行为病理学的发展，引发焦虑、失眠等问题。
3.现有技术公开了一种含有具有抗炎性质的肽组分的营养组合物及其用途，该专利指出对牛乳采用蛋白酶n酶解后得到一系列摩尔质量分布在500-2000da的酪蛋白肽具有抗炎活性。但其只关注了有效肽段的结构特征，并从肽的相对丰度即含量的差异层面进行研究。然而近年来，人们逐步认识到蛋白质水解物的生物活性不仅与鉴定肽的强活性有关，而且与它们的含量息息相关。由于受到蛋白质本身结构，氨基酸组成以及酶解条件的限制，在整个酶解物中靠提高某条或某几条生物活性肽的含量，很难从根本上提高整个酶解物的生物活性。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提出了酪蛋白抗炎小分子肽及其制备方法和在改善睡眠中的应用。
5.本发明的目的通过以下技术方案实现：
6.一种具有抗炎功效的酪蛋白小分子肽，所述具有抗炎功效的酪蛋白小分子肽显著降低小鼠炎症因子水平达到51.37％～75.75％。
7.优选的，所述具有抗炎功效的酪蛋白小分子肽含n端酪氨酸tyr的特征肽段占总肽段丰度的15.83％～21.75％，分子量《1000da的肽组分占79.45％～87.62％；所述含n端酪氨酸tyr特征肽段是特指在序列的氮末端为酪氨酸的多肽。
8.以上任一项所述的一种具有抗炎功效的酪蛋白小分子肽的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)加入酪蛋白和水，搅拌溶解，调节ph，制得酪蛋白分散液；
10.(2)向步骤(1)的酪蛋白分散液加入半胱氨酸蛋白酶和外肽酶，协同酶解，灭酶，并
冷却；
11.(3)加入丝氨酸蛋白酶酶解，灭酶，并冷却；
12.(4)离心，取上清液，为具有抗炎功效、富含n末端tyr特征肽段的酪蛋白小分子肽溶液。
13.优选的，步骤(1)中，所述酪蛋白的来源，包括但不限于牛乳、水牛乳、山羊乳或绵羊乳中的一种以上；所述酪蛋白和水按照的质量比为1:6～1:15；所述酪蛋白分散液的ph为7.0～8.0。
14.优选的，步骤(2)中，所述半胱氨酸蛋白酶为木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶中的一种以上。
15.更优选的，所述半胱氨酸蛋白酶来源于番木瓜乳汁或菠萝果实中。
16.优选的，所述的外肽酶为风味蛋白酶或氨肽酶a中的一种以上。
17.更优选的，所述外肽酶来源于米曲霉或黑曲霉。
18.优选的，步骤(2)中，所述协同酶解的温度是40-55℃；所述协同酶解的时间是1-6h。
19.优选的，步骤(3)中，所述丝氨酸蛋白酶为碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶中的一种以上。
20.更优选的，所述碱性蛋白酶来源于芽孢杆菌或曲霉。
21.更优选的，所述胰凝乳蛋白酶来源于牛或猪的胰脏。
22.更优选的，所述羧肽酶的来源包括但不限于牛或猪的胰脏、酵母或曲霉。
23.优选的，所述酶解的温度是40-50℃；所述酶解的时间是1-6h。
24.优选的，步骤(2)所述半胱氨酸蛋白酶和外肽酶及步骤(3)所述丝氨酸蛋白酶的总蛋白酶添加量是酪蛋白质量的0.5％～2.0％；半胱氨酸蛋白酶、外肽酶和丝氨酸蛋白酶的质量比为(0.5～1.0):(0.5～1.0):(1.0～2.0)。
25.优选的，步骤(2)所述灭酶、步骤(3)所述灭酶均是将酶解液升温至85～100℃保温15～30min。
26.优选的，步骤(4)中，所述离心是8000～10000rpm、4℃离心15～20min。
27.优选的，步骤(4)所述上清液浓缩后，进行喷雾干燥，得到富含n端酪氨酸tyr特征肽段的酪蛋白小分子肽粉。
28.以上任一项所述的一种具有抗炎功效的酪蛋白小分子肽在制备改善睡眠的药物和保健品中的应用。
29.优选的，所述酪蛋白小分子肽可延长睡眠时间1.7倍以上。
30.优选的，所述的改善睡眠是指缓解由焦虑、压力引发的脑部神经炎症从而改善失眠问题。
31.优选的，所述药物和保健品的形式是粉末冲剂、功能饮料、压片糖果、凝胶软糖、口服液中的一种以上。
32.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
33.本发明具有抗炎功效的酪蛋白小分子肽对慢性压力应激诱导的小鼠神经炎症具有良好的改善作用，表明具有潜在的缓解情绪、失眠问题的功效，可用于制备改善睡眠类药物或保健品，也可与其他保健品或食品添加剂复配使用。
34.本发明采用特定的半胱氨酸蛋白酶协同外肽酶与丝氨酸蛋白酶分步水解并控制含n-tyr-特征肽段的定向释放，避免过度酶解对特征肽段的破坏，从而显著提高酪蛋白肽中目标肽段含量，同时又能提高《1000da小分子肽组分的含量。
35.本发明所制备的酪蛋白小分子肽其中含n-tyr-特征肽段含量高，可达15.83％～21.75％，且分子量小，《1000da组分占79％以上，能够显著降低炎症因子水平，同时显著改善睡眠。
附图说明
36.图1为实施例和对比例所得酪蛋白小分子肽对慢性压力应激诱导的炎症小鼠中tnf-α因子释放量的影响图。
37.图2为实施例和对比例所得酪蛋白小分子肽对慢性压力应激诱导的炎症小鼠中il-6因子释放量的影响图。
38.图3为实施例和对比例所得酪蛋白小分子肽对慢性压力应激诱导的炎症小鼠中il-1β因子释放量的影响图。
39.图4为实施例和对比例所得酪蛋白小分子肽对慢性压力应激诱导的炎症小鼠中戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为的影响图。
40.图5为实施例和对比例所得酪蛋白小分子肽的肽分子量分布图。
具体实施方式
41.以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
42.实施例与对比例中使用的酪蛋白均为商品化试剂。
43.实施例中所使用的蛋白酶均为商品化试剂，木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶的来源为番木瓜乳汁或菠萝果实；风味蛋白酶或氨肽酶a的来源为米曲霉或黑曲霉；碱性蛋白酶来源于芽孢杆菌或曲霉；胰凝乳蛋白酶来源于牛或猪的胰脏；羧肽酶的来源包括但不限于牛或猪的胰脏、酵母或曲霉。
44.本发明实施例中所涉及的实验指标及其方法如下：
45.(1)小鼠给药及处理
46.90只昆明小鼠(6-8周龄)被置于可控环境(25
±
2℃，12/12h光/暗循环)，饮食自由。其中80只经随机慢性压力(包括夹尾、限制行为、禁水、禁食、倾斜笼子、昼夜颠倒、湿笼等)应激处理为期2周，随机分组(n＝10)：正常组(正常小鼠，不经过压力刺激)、模型组(压力刺激但不给药)以及酪蛋白肽组(每组在压力刺激的同时分别口服灌胃实施例1-4和对比例1-3制备的酪蛋白抗炎小分子肽/酪蛋白75mg/kg)。酪蛋白肽组小鼠以75mg/kg给药量处理7天，同时压力刺激，即模型组和酪蛋白肽组共刺激21天，同时探究预防和辅助治疗两种方式。随后，最后一次灌胃后，禁食12h以上，处死，取组织。
47.(2)炎症因子水平测定
48.立即收集小鼠脑组织，用预冷磷酸盐缓冲盐水(pbs,ph 7.4)洗涤后，均质，然后离
心(3500
×
g,10min,4℃)得到上清。组织中炎症因子白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-1β(il-1β)及肿瘤坏死因子(tnf-α)的浓度严格按照制造商的说明使用商业试剂盒进行测定。
49.(3)戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠行为学测定
50.参考《保健食品检验与评价技术规范》中第十章、改善睡眠功能检验方法进行测定。小鼠在末次口服后30分钟开始注射戊巴比妥钠(42mg/kg，腹腔注射)。然后记录15分钟内翻正反射消失后入睡的小鼠数量。用秒表记录小鼠2h内的睡眠潜伏期和睡眠持续时间。
51.(4)特征肽段鉴定方法
52.样品前处理：由酶解工艺制得的上清液立即与0.1％甲酸-乙腈以1:3的体积比混合，在4℃下放置2～4h，4℃、8000g离心10～15min，取上清液用流动相0.1％甲酸水稀释至0.5mg/ml，过0.22μm滤膜于液相小瓶中，于-20℃冷冻保存备用，24h内进行质谱分析。质谱分析：使用超高效液相色谱联用质谱(uplc-ms/ms)鉴定生物活性肽，采用梯度洗脱色谱分离，联用二级质谱鉴定并定量，洗脱速度为0.2ml/min，进样量为2μl。流动相a为体积百分比浓度0.1％甲酸水，b为乙腈(色谱纯)，洗脱程序为：0～10min，5％～40％ b；10～12min，40％～90％ b；12～14min，90％ b；14～15min，90％～5％ b；15～18min，5％ b平衡至初始状态。质谱参数：电子轰击离子源能量7ev，毛细管电压4500v，离子源温度200℃，干燥气体流量8.0l/min，雾化器压力1.5bar，质量扫描范围m/z 50～1500。
53.实施例1
54.(1)按照质量份数1:6分别称量加入牛乳酪蛋白和蒸馏水，适度搅拌溶解，制得酪蛋白分散液，使用4m的naoh溶液调节反应体系ph值至8.0；
55.(2)向步骤(1)的反应体系加入质量百分比为0.5％的木瓜蛋白酶和0.5％的氨肽酶a(以酪蛋白质量计)，50℃下酶解2h，100℃灭酶15min，并冷却至50℃；
56.(3)向步骤(2)的反应体系加入质量百分比为1％的胰凝乳蛋白酶(以酪蛋白质量计)，50℃下酶解4h，升温至95℃灭酶20min，并冷却；
57.(4)离心取上清液，为具有抗炎功效、富含n末端tyr-特征肽段的酪蛋白小分子肽溶液。
58.实施例2
59.(1)按照质量份数1:8分别称量加入水牛乳酪蛋白和蒸馏水，适度搅拌溶解，制得酪蛋白分散液，使用4m的naoh溶液调节反应体系ph值至7.0；
60.(2)向步骤(1)的反应体系加入质量百分比为0.1％的木瓜蛋白酶和0.2％风味蛋白酶(以酪蛋白质量计)，55℃下酶解6h，90℃灭酶20min，并冷却至50℃；
61.(3)向步骤(2)的反应体系加入质量百分比为0.2％的碱性蛋白酶(以酪蛋白质量计)，50℃下酶解1h，升温至100℃灭酶15min，并冷却；
62.(4)离心取上清液，为具有抗炎功效、富含n末端tyr-特征肽段的酪蛋白小分子肽溶液。
63.实施例3
64.(1)按照质量份数1:15分别称量加入山羊乳酪蛋白和蒸馏水，适度搅拌溶解，制得酪蛋白分散液，使用4m的naoh溶液调节反应体系ph值至8.0；
65.(2)向步骤(1)的反应体系加入质量百分比为0.6％的菠萝蛋白酶和0.6％的氨肽酶a(以酪蛋白质量计)，40℃下酶解4h，85℃灭酶30min，并冷却至45℃；
66.(3)向步骤(2)的反应体系加入质量百分比为0.6％的羧肽酶(以酪蛋白质量计)，45℃下酶解4h，升温至90℃灭酶20min，并冷却；
67.(4)离心取上清液，为具有抗炎功效、富含n末端tyr-特征肽段的酪蛋白小分子肽溶液。
68.实施例4
69.(1)按照质量份数1:12分别称量加入绵羊乳酪蛋白和蒸馏水，适度搅拌溶解，制得酪蛋白分散液，使用4m的naoh溶液调节反应体系ph值至7.0；
70.(2)向步骤(1)的反应体系加入质量百分比为0.8％的菠萝蛋白酶和0.4％风味蛋白酶(以酪蛋白质量计)，55℃下酶解6h，95℃灭酶15min，并冷却至50℃；
71.(3)向步骤(2)的反应体系加入质量百分比为0.8％的胰凝乳蛋白酶(以酪蛋白质量计)，50℃下酶解1h，升温至85℃灭酶30min，并冷却；
72.(4)离心取上清液，为具有抗炎功效、富含n末端tyr-特征肽段的酪蛋白小分子肽溶液。
73.对以上实施例所得上清液浓缩后，进行喷雾干燥，可得富含n端酪氨酸tyr特征肽段的酪蛋白小分子肽粉。
74.对比例1
75.不经过酶解处理的原料纯酪蛋白。
76.对比例2
77.(1)按照质量份数1:15分别称量加入牛乳酪蛋白和蒸馏水，适度搅拌溶解，制得酪蛋白分散液，调节反应体系ph值至7.0；
78.(2)向步骤(1)的反应体系加入质量百分比为0.05％的木瓜蛋白酶(以酪蛋白质量计)，50℃下酶解6h，100℃灭酶15min，并冷却；
79.(3)离心取上清液，获得酪蛋白肽溶液。
80.对比例3
81.(1)按照质量份数1:12分别称量加入水牛乳酪蛋白和蒸馏水，适度搅拌溶解，制得酪蛋白分散液，调节反应体系ph值至8.0；
82.(2)向步骤(1)的反应体系加入质量百分比为1％的胰凝乳蛋白酶蛋白酶(以酪蛋白质量计)，50℃下酶解4h，100℃灭酶15min，并冷却至55℃；
83.(3)向步骤(2)的反应体系加入质量百分比为0.1％的风味蛋白酶(以酪蛋白质量计)，55℃下酶解4h，升温至90℃灭酶20min，并冷却；
84.(4)离心取上清液，获得酪蛋白肽溶液。
85.图1-图4为不同实施例和对比例处理对压力应激诱导小鼠神经炎症反应的影响。结果如下，压力应激处理使小鼠神经炎症因子水平极显著增加，同样，压力应激处理显著缩短了戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，表明模型组中的小鼠经压力应激后引发神经炎症反应及失眠。
86.图5为不同实施例和对比例处理对酪蛋白酶解产物分子量分布的影响。结果如下，不同酶解工艺处理使酪蛋白小分子肽比例显著增加即＜1000da组分，其中对比例为未经过水解的纯酪蛋白，蛋白含量高于92％，分子量在57000-375000da左右。
87.采用本发明工艺酶解制备所得酪蛋白蛋白小分子肽(实施例1-4)处理，显著降低
了小鼠神经炎症因子水平，降低小鼠炎症因子水平达到51.37％～75.75％，并且显著延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，且其二者恢复率显著高于酪蛋白原料即对比例1和其他普通酶解工艺即对比例2和3。这可能跟表1中的结果紧密相关，不同酪蛋白酶解产物中释放的不同比例的含n末端tyr-特征肽段，从而在小鼠压力应激模型中表现出优于对比例的抗炎及改善睡眠功效。
88.表1为不同实施例和对比例中酪蛋白小分子肽释放含n末端tyr-特征肽段占比差异情况，结果表明，实施例1-3中特征肽段所占比例明显高于对比例1-3。已有研究表明，含芳香族疏水性氨基酸的肽具有缓解神经炎症，改善睡眠的功效；并且此前也有研究提出n末端tyr在改善睡眠肽中的重要性。因此实施例1-3的抗炎及改善睡眠功效显著优于对比例1-3。
89.并且，参考国家标准《gb/t 22492-2008大豆肽粉》中的方法，测定各实施例及对比例中酪蛋白小分子肽的分子量分布。实施例1、2和3酪蛋白小分子肽中，《1000da分别占87.62％、80.25％和82.97％，小分子肽含量显著高于未采用外肽酶和丝氨酸蛋白酶水解对比例2(59.01％)和未采用半胱氨酸蛋白酶水解并对调第一、二步酶解顺序的对比例3(74.78％)。
90.表1
[0091][0092]
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。